MF1739_3 PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES CON ÓRGANOS AISLADOS, TEJIDOS Y CÉLULAS DE ANIMALES

– Aplicar técnicas de mantenimiento de órganos aislados, tejidos y células animales mediante el empleo de equipos, soluciones y medios de cultivo específicos.
– Aplicar técnicas de obtención de órganos o tejidos animales según protocolos habituales.
– Aplicar técnicas de criopreservación de cultivos de células animales según protocolos para su conservación.
– Aplicar procedimientos experimentales con órganos aislados, tejidos y células animales que permitan obtener resultados de investigación.

MÓDULO 1. Procedimientos Experimentales con Órganos Aislados, Tejidos y Células de Animales
UNIDAD DIDÁCTICA 1. CULTIVOS DE CÉLULAS, TEJIDOS Y ÓRGANOS PROCEDENTES DE ANIMALES
Histología y fisiología celular básica.
– Concepto de morfología y fisiología
– Niveles de organización. Relación entre estructura y función
– Clasificación de los tejidos
Proliferación y diferenciación celular. Adhesión celular.
– Concepto de proliferación y diferenciación celular (especialización)
– Factores reguladores: Señales endógenas y exógenas
– Contacto directo célula-célula. Moléculas de adhesión
Tipos de células básicas y características tanto morfológicas como fisiológicas.
– Célula procariota: estructura y funciones básicas
– Célula eucariota: Organización, estructura y función de los diferentes orgánulos celulares, organización función del núcleo.
– Descripción de algunos tipos de células que se suelen utilizar en cultivos celulares: tumorales, epiteliales, Tejido conjuntivo, Tejido muscular, Tejido nervioso, Sangre, tejidos linfoides y Células madre.
Métodos alternativos al empleo de animales en investigación.
– Ventajas de los ensayos in vitro: Ética y legislación, Control del medio extracelular, Homogeneidad de la muestra, Disminución del gasto y tiempo, objetivables y cuantificables, precisión, reproducibilidad, etc.
– Limitaciones: Excesiva sensibilidad, Límite de producción, Inestabilidad, Validación del modelo, etc.
Obtención de células. Cultivos celulares primarios. Obtención de una línea celular.
– Sistemas para la obtención de células: Banco de células o aislamiento a partir de un tejido
– Métodos de aislamiento del tejido, disección/disgregación
– Requisitos especiales para el cultivo de células primarias
– Ventajas e inconvenientes de la utilización de células primarias.
– Conservación o mantenimiento células primarias. Requisitos especiales para el cultivo de células primarias.
Evolución de las líneas celulares y líneas celulares inmortalizadas. Desarrollo de líneas celulares continuas.
– Tipos de líneas celulares establecidas. Células en monocapa y células en suspensión. Células inmortalizadas y transformadas
– Preparación de las líneas.
– Control de los cultivos celulares (pH, sobrecrecimiento, estado del medio, contaminación, etc.)
– Recuento de células. Preparación de células en suspensión y de células adherentes. Uso del hemocitómetro.
– Subcultivos de células. Curva de crecimiento.
– Métodos para aumentar la producción.
– Ventajas y desventajas de la líneas celulares estables
Bases de datos y bancos de líneas celulares y material biológico:
– Qué es un banco de células
– Bancos internacionales más importantes: American Type Culture Collection (ATCC) y European Collection of Cell Cultures (ECACC), etc.
– Otros bancos de células: Banco Nacional de Líneas Celulares, etc.
Anatomía básica de órganos y tejidos empleados en investigación in vitro.
– Órganos y tejidos más comunes: hígado, corazón, riñón, páncreas, branquias, encéfalo, piel, sangre, etc
– Ingeniería de tejidos
Modelos con órganos y tejidos para procedimientos in vitro:
– Cultivo y baños de órganos
– Órganos perfundidos
– Explantes de órganos
– Órganos reconstituidos
– Ventajas e inconvenientes de los diversos tipos de modelos in vitro
Cultivos de órganos:
– Disección de órganos y tejidos para su extracción.
– Baños de tejidos y órganos. Equipamiento y medios de conservación.
– Obtención de explantes. Tamaño de la muestra, Perfusión de la muestra y equipamiento
UNIDAD DIDÁCTICA 2. MANIPULACIÓN DE CULTIVOS CELULARES Y CRIOPRESERVACIÓN
Equipos y material empleados en los cultivos de células y su mantenimiento:
– Cabinas de flujo laminar: tipos (vertical y horizontal) y nivel de protección (clase I, II y III)
– Incubadores: mantenimiento del nivel de CO2, temperatura y humedad
– Microscopios: Estándar e invertidos con ópticas de contraste de fases
– Frigoríficos, congeladores (de -20º y -80º C) y equipo de criogenia (unidad de almacenamiento en nitrógeno líquido (-196º C) de líneas celulares)
– Equipos de esterilización y filtración: autoclaves, esterilización por gas, por calor seco, sistema de filtración, purificación de agua, etc.
– Otros instrumentos: Balanzas, Baño termostático, centrífugas refrigeradas y no refrigeradas, Equipos de purificación de agua, Micropipetas de volumen variable o de volumen fijo, pHmetro, Pipeteadores automáticos
– Recipientes para cultivos: Placas de Petri, Multiplacas, Frascos de Roux de diferentes formas y tamaños o Especiales, como las «roller bottles» o con portaobjetos
Protocolos de trabajo en cabina de flujo laminar y en poyata de laboratorio.
– Inicio del trabajo en cabina: encendido y puesta a punto de la cabina, desinfección y recomendaciones para el trabajador.
– Durante la manipulación: distribución del material y utilización de la zona de trabajo, control del flujo y turbulencias de aire, actuación ante un vertido de material contaminado y alarmas.
– Al finalizar el trabajo: Limpieza, vaciado de material, apagado y cerrado de la cabina
– Mantenimiento: semanal (limpieza y desinfección de superficie y paredes, mensualmente (revisión de válvulas interiores) y anualmente se certificará por una entidad cualificada.
– Mesa de trabajo o poyata de laboratorio: orden, limpieza y desinfección
Protocolos de manejo de placas de cultivos.
– Apertura del material estéril dentro de la cabina
– Marcaje de las placas en la tapa y en un lateral de la base, de manera distinta para cada placa, para evitar intercambiar tapas.
– Toma del medio con la pipeta y transferencia a la placa entreabierta (no retirar la tapa)
– Tratamiento como residuo según riesgo biológico del cultivo
Áreas de un laboratorio de cultivo de tejidos.
– Área de preparación de medios: equipamiento
– Área de limpieza y esterilización: dimensiones mínimas, organización y equipamiento (máquinas de lavado de material y esterilizadores)
– Área de transferencia: cabina de flujo laminar/seguridad biológica y otros equipos
– Área de incubación o cámaras de crecimiento: control de iluminación, temperatura y humedad. Alarmas
Lavado, esterilización y preparación de materiales:
– Vidrio: pipetas, probetas, vasos, matraces y botellas de vidrio para preparación, almacenamiento y clasificación de medios y reactivos
– Plástico: Cultivos en placas y botellas, tubos de ensayo para diferentes técnicas y preparación de alícuotas de los reactivos
– Lavado, preparación y esterilización del material: área específica del laboratorio, con el método y desinfectantes adecuados
– Métodos de esterilización: Calor directo, flameado; Calor seco, Horno Pasteur y Calor Húmedo, Autoclave
Contaminaciones cruzadas y microbiológicas y su prevención.
– Principales contaminantes: microorganismos, otras líneas celulares del laboratorio y contaminación química
– Fuentes de la contaminación accidental: origen del cultivo tejido o células, proceso de manipulación del cultivo, empleo de reactivos biológicos contaminados, material contaminado y ambiente de trabajo
– Prevención para evitar contaminaciones: obtener siempre los cultivos de centros reconocidos que certifiquen el origen; trabajar bajo unas correctas normas de trabajo, limpieza y esterilidad, utilización de Inhibidores del crecimiento de los contaminantes (antibióticos y antifúngicos), etc.
Características y naturaleza del sustrato en cultivos celulares.
– Tipos de sustratos
– Factores de adhesión celular
– Interacciones células-substrato: Medios semisólidos: matrices.
– Métodos de disgregación celular: mecánicos, químicos y enzimáticos
Medios y reactivos de cultivo celular. Características principales, preparación y renovación.
– Características de los medios de cultivo celular: composición, osmoralidad, viscosidad, tensión superficial, especificidad, pH, capacidad tamponadora, esterilidad, etc.
– Componentes y suplementos: Agua, sales, glucosa, aminoácidos y vitaminas. Suero, factores de crecimiento y otros suplementos específicos. Indicador de pH. Pautas par el suplemento con antibioticos
– Tipos de medios. Medios libres de suero.
– Opciones para la elección, en polvo, líquido concentrado o listo para usar
– Preparación de medios líquidos, a partir de polvo (filtración) o esterilizados en autoclave
– Opciones para la elección, en polvo, líquido concentrado o listo para usar
– Preparación de medios líquidos, a partir de polvo (filtración), concentrados o esterilizables en autoclave
Factores de crecimiento y supervivencia de células en cultivo.
– Hormonas y factores de crecimiento
– Suero. tipos; suero de ternera (CF), suero bovino fetal (FCS) el suero de caballo (HS) y suero humano (HuS). Sustitutivos del suero
– Factores que afectan a la supervivencia de las células en un cultivo
Técnicas de mantenimiento de células en cultivo. Criopreservación de líneas celulares y métodos de identificación. Productos de criopreservación celular.
– Proceso de almacenamiento por congelación con agentes crioconservantes (glicerol, DMSO,…).
– Disminución progresiva de temperaturas hasta utilizar depósitos con nitrógeno líquido. Sistemas automáticos para la reducción progresiva y controlada de la temperatura.
– Factores que se favorecen con la criopreservación
– Identificación: Datos mínimos de indentificación de cada vial
– Procedimiento de descongelación
Empleo de cultivos celulares con fines experimentales. Detección de actividad metabólica y toxicológica.
– Aplicaciones: estudio de las propias células, clonación, el cáncer, biología del desarrollo, investigación en biología celular y bioquímica, en farmacología y toxicología, obtención de anticuerpos u hormonas, técnicas diagnósticas, etc.
– Ventajas de la utilización de cultivos celulares en el campo de la toxicidad
– Limitaciones de los ensayos in Vitro para estudios de toxicidad
– Ensayos utilizados en pruebas de citotoxicidad: Pruebas citológicas: observación al microscopio, Pruebas bioquímicas. Pruebas de viabilidad (de respuesta inmediata o de corto plazo y de respuesta a largo plazo o de supervivencia)
– Células asesinas
– Requisitos de las pruebas de citotoxicidad
– Preparación de las células efectoras y diana
– Prueba de citotoxicidad
– Resultados e interpretación
UNIDAD DIDÁCTICA 3. PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES CON ÓRGANOS AISLADOS, TEJIDOS Y CÉLULAS ANIMALES
Experimentos con cultivos de tejidos de origen animal mediante su exposición a sustancias o elementos terapéuticos o tóxicos.
– Estudios del efecto de diferentes sustancias en cultivos con tejidos y órganos diana. Aplicaciones
– Estudios del efecto de diferentes sustancias en cultivos de células (primarias o líneas establecidas). Aplicaciones
Técnicas de valoración del crecimiento y la viabilidad celular.
– Rojo neutro
– Prueba MTT
– Liberación al medio de la láctico deshidrogenasa (LDH)
– Ensayos de fluorescencia
– Toxicidad relativa: (concentración efectiva en el 50 % de las células)
Recolección de células y sus productos.
– Recolección de las células de los cultivos: centrifugación continua o filtración y extracción en régimen continuo
– Sistemas cromatográficos para el aislamiento y purificación de las toxinas. Equipos relacionados
Prevención de riesgos laborales en la manipulación de órganos, tejidos y células.
– Principales riesgos biológicos
– Evaluación de riesgos: Propiedades intrínsecas del cultivo celular, como resultado de la modificación genética, como resultado de una infección con agentes patógenos. Condiciones de trabajo
– Normas de trabajo en los laboratorios de cultivos celulares
UNIDAD DIDÁCTICA 4. INSTRUMENTACIÓN Y MÉTODOS DE REGISTRO DE SEÑALES A PARTIR DE ÓRGANOS AISLADOS, TEJIDOS Y CÉLULAS ANIMALES
Procesamiento de señales:
– Esquema general: transductor, amplificador y sistema de registro
– Equipos de espectroscopia de Bioimpedancia eléctrica
– Equipos de medida de la biomasa
Transductores: de fuerza, de presión, de temperatura.
Electrodos para biopotenciales y bioquímicos.
Ruidos en la salida de datos y métodos de filtrado.
Programas informáticos de recogida de datos.