MF1739_3 PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES CON ÓRGANOS AISLADOS, TEJIDOS Y CÉLULAS DE ANIMALES

1. MÓDULO 1. Procedimientos Experimentales con Órganos Aislados, Tejidos y Células de Animales

UNIDAD DIDÁCTICA 1. CULTIVOS DE CÉLULAS, TEJIDOS Y ÓRGANOS PROCEDENTES DE ANIMALES

1. Histología y fisiología celular básica.
2. – Concepto de morfología y fisiología
3. – Niveles de organización. Relación entre estructura y función
4. – Clasificación de los tejidos
5. Proliferación y diferenciación celular. Adhesión celular.
6. – Concepto de proliferación y diferenciación celular (especialización)
7. – Factores reguladores: Señales endógenas y exógenas
8. – Contacto directo célula-célula. Moléculas de adhesión
9. Tipos de células básicas y características tanto morfológicas como fisiológicas.
10. – Célula procariota: estructura y funciones básicas
11. – Célula eucariota: Organización, estructura y función de los diferentes orgánulos celulares, organización función del núcleo.
12. – Descripción de algunos tipos de células que se suelen utilizar en cultivos celulares: tumorales, epiteliales, Tejido conjuntivo, Tejido muscular, Tejido nervioso, Sangre, tejidos linfoides y Células madre.
13. Métodos alternativos al empleo de animales en investigación.
14. – Ventajas de los ensayos in vitro: Ética y legislación, Control del medio extracelular, Homogeneidad de la muestra, Disminución del gasto y tiempo, objetivables y cuantificables, precisión, reproducibilidad, etc.
15. – Limitaciones: Excesiva sensibilidad, Límite de producción, Inestabilidad, Validación del modelo, etc.
16. Obtención de células. Cultivos celulares primarios. Obtención de una línea celular.
17. – Sistemas para la obtención de células: Banco de células o aislamiento a partir de un tejido
18. – Métodos de aislamiento del tejido, disección/disgregación
19. – Requisitos especiales para el cultivo de células primarias
20. – Ventajas e inconvenientes de la utilización de células primarias.
21. – Conservación o mantenimiento células primarias. Requisitos especiales para el cultivo de células primarias.
22. Evolución de las líneas celulares y líneas celulares inmortalizadas. Desarrollo de líneas celulares continuas.
23. – Tipos de líneas celulares establecidas. Células en monocapa y células en suspensión. Células inmortalizadas y transformadas
24. – Preparación de las líneas.
25. – Control de los cultivos celulares (pH, sobrecrecimiento, estado del medio, contaminación, etc.)
26. – Recuento de células. Preparación de células en suspensión y de células adherentes. Uso del hemocitómetro.
27. – Subcultivos de células. Curva de crecimiento.
28. – Métodos para aumentar la producción.
29. – Ventajas y desventajas de la líneas celulares estables
30. Bases de datos y bancos de líneas celulares y material biológico:
31. – Qué es un banco de células
32. – Bancos internacionales más importantes: American Type Culture Collection (ATCC) y European Collection of Cell Cultures (ECACC), etc.
33. – Otros bancos de células: Banco Nacional de Líneas Celulares, etc.
34. Anatomía básica de órganos y tejidos empleados en investigación in vitro.
35. – Órganos y tejidos más comunes: hígado, corazón, riñón, páncreas, branquias, encéfalo, piel, sangre, etc
36. – Ingeniería de tejidos
37. Modelos con órganos y tejidos para procedimientos in vitro:
38. – Cultivo y baños de órganos
39. – Órganos perfundidos
40. – Explantes de órganos
41. – Órganos reconstituidos
42. – Ventajas e inconvenientes de los diversos tipos de modelos in vitro
43. Cultivos de órganos:
44. – Disección de órganos y tejidos para su extracción.
45. – Baños de tejidos y órganos. Equipamiento y medios de conservación.
46. – Obtención de explantes. Tamaño de la muestra, Perfusión de la muestra y equipamiento

UNIDAD DIDÁCTICA 2. MANIPULACIÓN DE CULTIVOS CELULARES Y CRIOPRESERVACIÓN

1. Equipos y material empleados en los cultivos de células y su mantenimiento:
2. – Cabinas de flujo laminar: tipos (vertical y horizontal) y nivel de protección (clase I, II y III)
3. – Incubadores: mantenimiento del nivel de CO2, temperatura y humedad
4. – Microscopios: Estándar e invertidos con ópticas de contraste de fases
5. – Frigoríficos, congeladores (de -20º y -80º C) y equipo de criogenia (unidad de almacenamiento en nitrógeno líquido (-196º C) de líneas celulares)
6. – Equipos de esterilización y filtración: autoclaves, esterilización por gas, por calor seco, sistema de filtración, purificación de agua, etc.
7. – Otros instrumentos: Balanzas, Baño termostático, centrífugas refrigeradas y no refrigeradas, Equipos de purificación de agua, Micropipetas de volumen variable o de volumen fijo, pHmetro, Pipeteadores automáticos
8. – Recipientes para cultivos: Placas de Petri, Multiplacas, Frascos de Roux de diferentes formas y tamaños o Especiales, como las «roller bottles» o con portaobjetos
9. Protocolos de trabajo en cabina de flujo laminar y en poyata de laboratorio.
10. – Inicio del trabajo en cabina: encendido y puesta a punto de la cabina, desinfección y recomendaciones para el trabajador.
11. – Durante la manipulación: distribución del material y utilización de la zona de trabajo, control del flujo y turbulencias de aire, actuación ante un vertido de material contaminado y alarmas.
12. – Al finalizar el trabajo: Limpieza, vaciado de material, apagado y cerrado de la cabina
13. – Mantenimiento: semanal (limpieza y desinfección de superficie y paredes, mensualmente (revisión de válvulas interiores) y anualmente se certificará por una entidad cualificada.
14. – Mesa de trabajo o poyata de laboratorio: orden, limpieza y desinfección
15. Protocolos de manejo de placas de cultivos.
16. – Apertura del material estéril dentro de la cabina
17. – Marcaje de las placas en la tapa y en un lateral de la base, de manera distinta para cada placa, para evitar intercambiar tapas.
18. – Toma del medio con la pipeta y transferencia a la placa entreabierta (no retirar la tapa)
19. – Tratamiento como residuo según riesgo biológico del cultivo
20. Áreas de un laboratorio de cultivo de tejidos.
21. – Área de preparación de medios: equipamiento
22. – Área de limpieza y esterilización: dimensiones mínimas, organización y equipamiento (máquinas de lavado de material y esterilizadores)
23. – Área de transferencia: cabina de flujo laminar/seguridad biológica y otros equipos
24. – Área de incubación o cámaras de crecimiento: control de iluminación, temperatura y humedad. Alarmas
25. Lavado, esterilización y preparación de materiales:
26. – Vidrio: pipetas, probetas, vasos, matraces y botellas de vidrio para preparación, almacenamiento y clasificación de medios y reactivos
27. – Plástico: Cultivos en placas y botellas, tubos de ensayo para diferentes técnicas y preparación de alícuotas de los reactivos
28. – Lavado, preparación y esterilización del material: área específica del laboratorio, con el método y desinfectantes adecuados
29. – Métodos de esterilización: Calor directo, flameado; Calor seco, Horno Pasteur y Calor Húmedo, Autoclave
30. Contaminaciones cruzadas y microbiológicas y su prevención.
31. – Principales contaminantes: microorganismos, otras líneas celulares del laboratorio y contaminación química
32. – Fuentes de la contaminación accidental: origen del cultivo tejido o células, proceso de manipulación del cultivo, empleo de reactivos biológicos contaminados, material contaminado y ambiente de trabajo
33. – Prevención para evitar contaminaciones: obtener siempre los cultivos de centros reconocidos que certifiquen el origen; trabajar bajo unas correctas normas de trabajo, limpieza y esterilidad, utilización de Inhibidores del crecimiento de los contaminantes (antibióticos y antifúngicos), etc.
34. Características y naturaleza del sustrato en cultivos celulares.
35. – Tipos de sustratos
36. – Factores de adhesión celular
37. – Interacciones células-substrato: Medios semisólidos: matrices.
38. – Métodos de disgregación celular: mecánicos, químicos y enzimáticos
39. Medios y reactivos de cultivo celular. Características principales, preparación y renovación.
40. – Características de los medios de cultivo celular: composición, osmoralidad, viscosidad, tensión superficial, especificidad, pH, capacidad tamponadora, esterilidad, etc.
41. – Componentes y suplementos: Agua, sales, glucosa, aminoácidos y vitaminas. Suero, factores de crecimiento y otros suplementos específicos. Indicador de pH. Pautas par el suplemento con antibioticos
42. – Tipos de medios. Medios libres de suero.
43. – Opciones para la elección, en polvo, líquido concentrado o listo para usar
44. – Preparación de medios líquidos, a partir de polvo (filtración) o esterilizados en autoclave
45. – Opciones para la elección, en polvo, líquido concentrado o listo para usar
46. – Preparación de medios líquidos, a partir de polvo (filtración), concentrados o esterilizables en autoclave
47. Factores de crecimiento y supervivencia de células en cultivo.
48. – Hormonas y factores de crecimiento
49. – Suero. tipos; suero de ternera (CF), suero bovino fetal (FCS) el suero de caballo (HS) y suero humano (HuS). Sustitutivos del suero
50. – Factores que afectan a la supervivencia de las células en un cultivo
51. Técnicas de mantenimiento de células en cultivo. Criopreservación de líneas celulares y métodos de identificación. Productos de criopreservación celular.
52. – Proceso de almacenamiento por congelación con agentes crioconservantes (glicerol, DMSO,…).
53. – Disminución progresiva de temperaturas hasta utilizar depósitos con nitrógeno líquido. Sistemas automáticos para la reducción progresiva y controlada de la temperatura.
54. – Factores que se favorecen con la criopreservación
55. – Identificación: Datos mínimos de indentificación de cada vial
56. – Procedimiento de descongelación
57. Empleo de cultivos celulares con fines experimentales. Detección de actividad metabólica y toxicológica.
58. – Aplicaciones: estudio de las propias células, clonación, el cáncer, biología del desarrollo, investigación en biología celular y bioquímica, en farmacología y toxicología, obtención de anticuerpos u hormonas, técnicas diagnósticas, etc.
59. – Ventajas de la utilización de cultivos celulares en el campo de la toxicidad
60. – Limitaciones de los ensayos in Vitro para estudios de toxicidad
61. – Ensayos utilizados en pruebas de citotoxicidad: Pruebas citológicas: observación al microscopio, Pruebas bioquímicas. Pruebas de viabilidad (de respuesta inmediata o de corto plazo y de respuesta a largo plazo o de supervivencia)
62. – Células asesinas
63. – Requisitos de las pruebas de citotoxicidad
64. – Preparación de las células efectoras y diana
65. – Prueba de citotoxicidad
66. – Resultados e interpretación

UNIDAD DIDÁCTICA 3. PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES CON ÓRGANOS AISLADOS, TEJIDOS Y CÉLULAS ANIMALES

1. Experimentos con cultivos de tejidos de origen animal mediante su exposición a sustancias o elementos terapéuticos o tóxicos.
2. – Estudios del efecto de diferentes sustancias en cultivos con tejidos y órganos diana. Aplicaciones
3. – Estudios del efecto de diferentes sustancias en cultivos de células (primarias o líneas establecidas). Aplicaciones
4. Técnicas de valoración del crecimiento y la viabilidad celular.
5. – Rojo neutro
6. – Prueba MTT
7. – Liberación al medio de la láctico deshidrogenasa (LDH)
8. – Ensayos de fluorescencia
9. – Toxicidad relativa: (concentración efectiva en el 50 % de las células)
10. Recolección de células y sus productos.
11. – Recolección de las células de los cultivos: centrifugación continua o filtración y extracción en régimen continuo
12. – Sistemas cromatográficos para el aislamiento y purificación de las toxinas. Equipos relacionados
13. Prevención de riesgos laborales en la manipulación de órganos, tejidos y células.
14. – Principales riesgos biológicos
15. – Evaluación de riesgos: Propiedades intrínsecas del cultivo celular, como resultado de la modificación genética, como resultado de una infección con agentes patógenos. Condiciones de trabajo
16. – Normas de trabajo en los laboratorios de cultivos celulares

UNIDAD DIDÁCTICA 4. INSTRUMENTACIÓN Y MÉTODOS DE REGISTRO DE SEÑALES A PARTIR DE ÓRGANOS AISLADOS, TEJIDOS Y CÉLULAS ANIMALES

1. Procesamiento de señales:
2. – Esquema general: transductor, amplificador y sistema de registro
3. – Equipos de espectroscopia de Bioimpedancia eléctrica
4. – Equipos de medida de la biomasa
5. Transductores: de fuerza, de presión, de temperatura.
6. Electrodos para biopotenciales y bioquímicos.
7. Ruidos en la salida de datos y métodos de filtrado.
8. Programas informáticos de recogida de datos.